酶组织化学定位PPT课件下载

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酶组织化学定位学院：生命科学专业：植物学姓名：马伟宝一、组织化学建立在形态学基础之上的组织化学属边缘科学范畴,是研究细胞和组织中的化学组成、定位与定量以及代谢状态的科学,其根本的目的是联系形态、化学成分、功能来了解细胞或组织的代谢变化。（一）、研究方法•化学方法、类化学方法、物理学方法、显微烧灰法等。与其他学科的关系•细胞学：细胞学把细胞看作生命活动的基本单位，从细胞、亚细胞和分子三个水平研究探索细胞的各种生命活动规律。•组织学：是阐明正常情况下细胞、组织、器官和系统的形态结构和其生理活动。•联系：他们都是组织化学的形态基础。•生物化学：一方面是进行细胞组织成分的化学分析，另一方面是对这些成分的化学反应分析。•联系：是组织化学反应原理的基础。•免疫学与组织化学：将抗原、抗体的特异性与组织化学的可见性巧妙的结合起来，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质。•分子生物学与组织化学：将碱基配对的分子杂交原理与组织化学结合，产生核酸原有位置上进行的细胞内核酸定性、定位。二、酶的组织化学定位•概念:用细胞内的酶具有催化底物的特性，并通过显色反应在切片或涂片上显示组织或细胞中内源性酶的活性及其定位的方法。•特点：①在原位检测•②检测酶的活性而不是酶分子本身（一）、酶组织化学发展历史•1939年以前：主要研究细胞内的氧化还原反应，未出现酶组织化学方法•（如Klebs和Stuve指出愈创木酯酊同脓作用能产生蓝色——过氧化物酶）•1939年：酶组织化学真正开始•高松英雄和Gomori——碱性磷酸酶（硫化钴反应、银反应）•同年，酸性磷酸酶组织化学方法也发表•1940-1950年：酶组织化学发展的黄金时期•创立了金属盐法、偶联偶氮色素法•50年代后：电镜酶组织化学•将超薄切片法和电镜技术应用到酶组织化学上，获得了酶的更精确的定位•60年代后期：免疫组织化学•利用抗原抗体特异性反应来定位酶蛋白•电镜免疫组化（二）、酶的种类•1.氧化还原酶•2.转移酶•3.水解酶•4.裂合酶（裂解酶）•5.异构酶•6.合成酶（连接酶）•目前，能用酶组织化学方法显示出来，并可进行定性、定位和定量的酶较少，仅200余种，因此潜力巨大（三）、酶组织化学反应的基本知识•1、酶的特性：水溶性，易扩散，难溶或不溶于有机溶剂、有机溶剂不同程度降低酶的活性、易受温度影响，对热耐受性弱、对干燥耐受性强•2、酶的定位：酶在细胞内或超微结构中存在的特定部位。•如：5’-核苷酸酶——浆膜•ATPase——肌球蛋白•细胞膜•线粒体3、酶组化的基本条件•同时保存结构和酶的活性•保存酶的定位，防止酶的扩散或移位•保证反应产物的特异性•*影响酶活性的因素：•温度PH值抑制剂激活剂•4、原理及一般原则•基本原理：细胞内的酶催化分解合适的底物，生成中间产物（即初级反应产物），然后其中之一再与辅助物（或捕捉剂）反应，生成有色不溶性的终反应产物，该反应产物沉积在原位，以显示酶的存在•第一反应：酶促反应••底物初级反应产物（PRP）•不可见••第二反应：捕捉反应••PRP+捕捉剂终反应产物（FRP）•一般原则：1、对组织处理,制片过程不能影响酶活性及分布2、所选底物和辅助物必须迅速、同步穿透入组织和细胞中3、所选底物最好只能被一种酶催化分解4.所选辅助物不影响细胞内酶的活性,不影响其他反应试剂的穿透性5.PRP必须迅速与辅助物反应,FRP为水不溶性的有色稳定产物6.所有参与反应的试剂均不能与其他成分吸附或结合5、酶组织化学的主要步骤•1、固定或不固定的标本•2、切片(冷冻或不冷冻)•3、孵育•4、显色•5、显微镜下观察6、各步骤注意问题•1、检测方法的选择•2、酶的保存与固定•一般新鲜组织快速冷冻,冰冻切片(-70℃长期保存；可用［丙酮∶氯仿=11∶］4℃，5～10分钟稍固定)•固定剂:抑制酶活性和细胞化学成分活性的重金属盐Hg、Cr、Pb等不能用做固定剂；慎用醛类•固定方法:浸泡固定灌流固定•固定温度:0—4℃•3、切片制作:切片厚度<40um，一般8～12um•4、缓冲液选择•缓冲液用于A.配置固定液•B.漂洗液•C.配置酶反应孵育液•选择缓冲液应注意•A.不能减弱目标酶的活性B.不能含有与捕捉机制相同的物质•C.注意漂洗用缓冲液的渗透压•D.漂洗用缓冲液原则上与固定液配置的缓冲液相同•5、孵育反应•A.孵育液配置:•底物浓度量要足够120(V/V);∶•孵育液只能用一次，配制时要适量•B.孵育的温度和时间:•3715-30min℃•C.切片孵育法-切片孵育•-漂浮孵育•6.酶特异性对照实验•用酶活性抑制剂•采用无底物的孵育液•过固定或加热•用针对目标酶的激活剂•改变孵育液底物•选择PH•酶细胞内的定位差异谢谢大家！