电镜细胞化学技术PPT课件下载(共56页)

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电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术电镜细胞化学技术从光镜组织化学的基础上发展起来，任务是研究细胞内各种成分在超微结构水平上分布情况以及这些化学成分在细胞活动过程中的动态变化。酶的细胞化学，免疫细胞化学，放射自显影以及各种细胞组成的生化分析等都属于电镜细胞化学的范围。酶细胞化学的发展情况酶细胞化学是从50年代末开始发展。酶在生命活动中占有极其重要的地位，离开了酶，一切生命活动所需的物质代谢将成为不可能。目前已知有2000多种酶。LM组织化学方法----显示出酶100多种EM细胞化学-----显示出酶80多种南医大电镜室----EM----显示出酶30多种酶细胞化学的意义酶的细胞化学定位对研究细胞的生理功能和病理过程有重要意义；很多酶可以作为细胞膜和各种细胞器的标志酶，而且有些细胞还有其特有的标志酶，这就为研究细胞器的结构与功能，细胞器的相互关系以及细胞的鉴别提供了一种新的武器。细胞器标志酶内质网核苷二磷酸酶，葡萄糖-6-磷酸酶高尔基体TPP（硫胺素焦磷酸酶），NADP(烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸酶）GERL和溶酶体ACP酶（酸性磷酸酶）线粒体细胞色素氧化酶，琥珀酸脱氢酶微粒体过氧化氢酶（H2O2酶）细胞膜（膜性结构）核糖核苷酸酶（如ATP酶），碱性磷酸酶细胞器和它们的标志酶酶细胞化学的基本原理在生物化学中，按照催化反应的性质将酶分成水解酶、氧化还原酶、转换酶、裂合酶、合成酶和异构酶六大类。但在细胞化学上可以检出的酶多数属水解酶和氧化还原酶两大类。一、水解酶底物酶＋条件初级反应产物捕捉剂最终反应产物捕捉剂通常是重金属（如铅、钡、铜等）一般来说，这些最终产物在细胞内的位置代表酶促反应的位置，也就是酶的定位。以酸性磷酸酶为例：ß－甘油磷酸钠酸性磷酸酶PH5.0ROH＋H3PO4Pb2+Pb3(PO4)2二、氧化还原酶包括氧化酶和脱氢酶，在氧化还原酶细胞化学方法中，包含着两个既分开又紧密联系的底物，在细胞化学中一个底物被还原，另一个被氧化。两个底物中，有一个是酶的理想底物，另一个是专门选择的在氧化还原时会起重要化学变化的某种物质，后一种底物有很多方面可看作是捕捉剂的等效物，称捕捉底物。氧化酶H2O2H2O氧化酶DABDAB氧化聚合物OsO4（锇酸）锇黑（高电子密度）脱氢酶琥珀酸盐延胡索酸盐琥珀酸脱氢酶高铁氰化物[Fe(CN)63¯]亚铁氰化物[Fe(CN)64¯]Cu2+亚铁氰化铜以琥珀酸脱氢酶为例注：Cu2+存在在柠檬酸钠或酒石酸钾钠条件下常用的酶细胞化学试验步骤一、取材与固定实验动物组织最好用灌注固定，人体活检标本以浸泡固定为主。用2％戊二醛固定液经血管灌注固定动物组织5分钟左右，然后取下所需的组织，切成宽1mm，长5－10mm长方形组织块，在同样的固定液中继续固定，固定时间随组织大小、种类而定。各种酶对固定液敏感度和耐受性也不同，必须根据具体情况选择固定液的温度、浓度、时间和PH。常用固定剂对超微结构和酶活性保存情况保存情况保存情况超微结构的情况酶活性超微结构的情况酶活性乙醛差好羟基乙二醛好好丙烯醛好—优秀差乙-甲基丙烯醛好好巴豆醛尚可好丙酮醛差差甲醛尚可优秀琥珀醛尚可好戊二醛优秀好丙醛尚可好乙二醛尚可，好好二、漂洗组织用0.1M二甲胂酸钠缓冲液（PH7.4）在4℃下漂洗组织，洗去戊二醛固定液，漂洗时间最少2小时以上，可以过夜。二甲胂酸钠缓冲液是最理想的漂洗液，因为它不干扰任何酶的细胞化学反应。三、切组织片将长条组织块埋在7％琼脂中，用组织切片机切成25μm－75μm的组织片，将切下的组织片浸泡在4℃的0.1M二甲胂酸钠缓冲液中；或将组织块用冰冻切片机切成所需厚度的组织片，但需防止冰晶的产生。也可用振荡切片机切成45μm左右的组织片。当被检查的材料被充分固定时，用冰冻切片机制作切片能较好的保持微细结构。当材料不能充分固定或不能被固定时，由于冷冻溶解能引起组织结构的损伤，所以用组织切片机或振荡切片机。对一些有方向性的组织，在切薄片前必须注意样品的定向，事先确定所需要细胞的位置。四、置换缓冲液将组织片放入配制孵育液用的缓冲液中，换液2－3次，每次5－10分钟，使组织内部建立细胞化学反应所需的PH条件，缓冲液温度须保持4℃左右。有些细胞化学反应中有预孵育步骤，即将组织片浸在没有底物的孵育液里20分钟左右，在酶与底物相遇之前使组织内部建立起所需的PH以及足够的捕捉剂的浓度。五、孵育将组织片放在新鲜配制的孵育液中，在室温或37℃水浴箱中孵育30分钟至2小时，孵育过程中不断振荡孵育液，使其容易扩散到组织内。孵育液要求现配现用，成分一般不能有大的变动，底物和捕捉剂的浓度、缓冲液的缓冲能力等必须保持在很窄的限度内；在一些孵育液的配方中，某些成分已接近溶解度的极限，因此在混合各种成分时必须特别小心。各种酶有其相应的孵育时间、温度、PH，必须严格遵守。六、漂洗组织首先用配制孵育液的缓冲液清洗组织，以去除孵育液中过剩试剂，一般换洗2－3次，每次5分钟，然后用0.1M二甲胂酸钠缓冲液漂洗，所用缓冲液保持在4℃左右。七、后固定用1％锇酸固定液对组织作后固定，由于组织较薄，在4℃下固定时间一般不超过1小时。为了更好的显示细胞的各种膜结构，可以用亚铁氰化钾还原的锇酸作后固定。八、脱水包埋按超薄切片技术中的常规方法进行脱水和环氧树脂包埋，但脱水时间缩短一半，且不用醋酸双氧铀作块染。对超薄切片染色要慎重，因为电子染色可能会模糊细胞化学反应的细节，染色液也可能会模糊细胞化学反应的细节，染色液也可能与细胞化学反应产物起作用。因此，首先必须观察未经染色的切片，只有确证染色对细胞化学反应产物没干扰的情况下才能做常规超薄切片染色。应用免疫电子显微技术免疫电子显微技术电镜免疫细胞化学技术电镜免疫细胞化学技术是在细胞超微结构水平上研究抗原抗体反应的部位并研究其动态变化。1959年，Singer首先提出用电子密度较高的铁蛋白(Ferritin)标记抗体的方法，使在细胞超显微水平上研究抗原抗体反应成为可能。在此基础上，相继发展了杂交抗体技术、铁蛋白抗铁蛋白复合物技术、免疫酶技术及胶体金标记技术等。对标记物的要求标记物必须是电子密度高的物质，在电镜下可识别标记物与抗体或与抗原反应必须不改变抗体或抗原的活性标记物在电子的轰击下不改变形状常用的标记物有铁蛋白、辣根过氧化物酶（HRP）、胶体金等基本操作组织固定与取材：固定要求保存良好的细胞超微结构和保持组织的抗原性，取材要求迅速、精细。固定液：过碘酸－赖氨酸－多聚甲醛液（PLP液），多聚甲醛－戊二醛混合液，4%多聚甲醛液免疫染色：包埋前染色、包埋后染色、超薄冰冻切片染色包埋：树脂包埋、低温包埋包埋前染色即先行免疫染色，在解剖显微镜下将免疫反应阳性部位取出，修整成小块，按常规电镜方法处理，经锇酸固定、脱水、包埋。包埋前染色的组织以中层较为理想；表层因受机械修整，结构往往保存不好；深层因抗体不能透入，免疫反应弱或无。在做超薄切片前应先做半薄切片，找出免疫反应阳性部位。优点：1.标本染色前不经过锇酸固定、脱水、包埋等过程，抗原未被破坏，易于获得良好的免疫反应。2.可在免疫反应阳性部位定位做超薄切片，提高电镜下的检出率。3.适于含抗原量较少的组织。缺点：由于经过一系列的免疫染色步骤，常出现一定的超微结构的损伤。包埋后染色组织标本经固定、脱水及树脂包埋，制成超薄切片后，再进行免疫组化染色。注意点：1、OsO4可使抗原活性明显降低。2、铜网易与化学物质产生反应，故需选镍网或金网。3、在免疫组化处理的全过程中，应注意保持网面湿润，以免影响抗原活性。优点：超微结构保存较好，方法简便，阳性结果有高度的可重复性，同一张切片上可进行多重免疫染色。缺点：抗原活性在电镜生物样品处理过程中可能减弱甚至丧失；包埋在环氧树脂中的组织不易进行免疫反应等。超薄冰冻切片染色将组织置于2.3mol/l蔗糖液中，投入液氮中速冻，在冰冻超薄切片机上切片。优点：样品抗原性保存较好，兼有包埋前和包埋后染色的优点。缺点：需配备冰冻超薄切片机，且技术难度较大。不论哪一种免疫电镜技术都面临微细结构的保存和组织中抗原活性的保存这一对矛盾。如戊二醛、锇酸等固定液有利于微细结构的保存，但抗原活性有影响；而H2O2能增加树脂穿透性，但对微细结构有损伤，能使反应部位产生孔洞。在生物样品的处理过程中，应同时注意到这两方面。其次，每次免疫染色中的清洗工作应注意彻底，否则非特异性产物和其他污染物会影响特异性反应物的显示和观察。免疫电镜胶体金标记法免疫电镜胶体金标记法金标法是Faulk和Taylor在1971年提出的，并首先用于免疫电镜。金标法是利用胶体金在碱性环境中带有负电荷的性质，使其与抗体相吸附，从而将抗体标记。LM:金标记的抗体与抗原反应时，呈鲜艳的樱红色EM:金颗粒具有很高的电子密度，清晰可见优点标记抗体不复杂，对微细结构损伤小。金颗粒电子密度高，在TEM下清晰可见。利用不同直径的金颗粒标记不同的抗体，是研究突出小泡内神经递质共存的有力工具。由抗原抗体反应部位结合金颗粒数量的多少可以进行粗略的免疫细胞化学定量分析。可以对培养细胞内抗原进行标记定位。金具有强烈的激发电子能力----可以用于TEM和SEM的观察。金标液无毒性，对人体无害。胶体金被科技工作者认为是当前最理想的标记物之一。操作步骤应用于电镜水平的免疫金染色法，可分为包埋前染色和包埋后染色，由于包埋前染色对细胞膜的穿透性差，一般只用于细胞表面的抗原标记；细胞内部的抗原标记普遍采用包埋后染色。包埋后染色1.超薄切片厚50~70nm左右，载于200~300网孔的镍网上。2.置1%H2O2内10min至1h，增进树脂穿透性，有利于抗体进入。滴入1%H2O2液1滴于蜡板上，将网的载片面轻浮于液滴上。3.双蒸水洗3次，每次10min，第一、二次洗法如步骤2，浮于液滴上，第三次以盛有双蒸水的加样器沿镍网面冲洗，水流应有适当压力，但不易过强，用滤纸在网缘将水吸干。4.浮于正常羊血清（1:50~1:100）滴上，室温30~60min，以饱和固定剂中的游离醛基占据非特异性结合部位，以阻断非特异性吸附。5.PBS漂洗3min，3次。6.滤纸吸干，孵育于第一抗体血清上，先室温预孵1h，再置于4℃冰箱24~36h。（从冰箱取出后需室温放置1h）7.PBS漂洗3min，3次。8.PBS（内含1%的牛血清白蛋白，PH8.2）中5min，此步为胶体金结合做准备。9.胶体金标记抗体液1:30~1:100，淡红色为适宜稀释液，室温孵育1h。10.双蒸水洗3min，3次。如作双重染色，则应将镍网翻过来，用另一类抗体血清，重复上述步骤2~10。11.枸橼酸铅染色5min，然后双蒸水洗。12.饱和醋酸铀染色5min，双蒸水洗净。13.电镜观察。应用组织内雌激素受体的组织内雌激素受体的CG-HRP-ECG-HRP-E22标记技术标记技术雌激素受体(ER)除存在于性器官外，几乎在全身器官或多或少的存在。对相应的组织进行ER的定性、定量检查，对研究疾病的发生、发展、诊断和治疗都有重要意义。有生化法、组化法、组化免疫法及新近发展起来的单克隆抗体，已有学者对这些方法进行评价。近来有的作者用辣根过氧化物酶(HRP)偶联雌二醇(E2)检测乳腺癌水平，并广泛地得到应用。上述方法均缺乏精确的定性和定量研究南医大电镜室首次将胶体金(CG)与HRP偶联E2结合作为配体形成了CG-HRP-E2，使ER在电镜下显示，可在细胞超微结构水平进行定位和定量分析。结果HRP-E2在LM下显示CG-HRP-E2在EM下显示相应的靶细胞核内和胞浆内有不同程度的胶体金颗粒分布附表：细胞浆与细胞核内的ER平均密度(颗粒数/0.12nm2)种类例数胞浆内胞核内增生期间腺细胞102.15±1.802.96±2.233.26±2.54增生期间质细胞101.50±1.22腺癌细胞61.34±1.813.22±1.28讨论CG稳定，迅速吸附蛋白质而不改变生物活性E2对靶细胞内ER有高度亲和力与专一性HRP和CG都是标记物创新之处在于把CG与HRP-E2（有售）相结合，形成CG-HRP-E2标记物，能很好标记靶细胞内的胞浆和胞核受体HRP-E2与CG-HRP-E2结果完全吻合在超微结构水平上进行精确的定性和定量方法可靠，试剂来源易，价格低廉本科研（国家自然科学基金资助—免疫电镜细胞化学部分）结果证明靶细胞中，核内ER明显多于浆内ER，为30年来关于核受体或浆受体的争论提供了一个有力的科学检测手段细胞形态立体计量学细胞形态立体计量学细胞形态立体计量学的意义是对细胞及其结构成分的形态进行定量分析的一种方法，也就是用立体学的方法来分析细胞形态结构（膜结构、颗粒结构、纤维结构）从二维图像推导三维空间结构，要用到几何概率论等一些数学方法，这一套方法称为立体学（Stereology）。将立体学的方法用在细胞形态的分析上，就是形态计量学（CellMorphometry）超薄切片获得的图像存在以下问题1.二维图像与三维结构细胞具有三位结构，而电镜的图像显示的只是二维形态。如何从二维图像导出三维图像?2.定性与定量电镜是定性观察，定量是指用统计学的方法对在电镜下所观察的有差别的图像进行统计学处理。3.抽样与统计一个细胞群体的细胞数目往往是很大的，电镜下观察的细胞只是一种抽样观察，其结果必须进行统计学处理。4.立体计量方法的可行性立体计量方法是一种数学方法，有严格的科学性。可以利用图像分析系统进行处理，如果实验室没有图像分析系统可以用人工的方法进行立体计量分析。细胞一些结构成分体积的相对测量一、体密度（Volumedensity）表示结构体积在参照系体积中占有的相对大小的结构参数，以Vv表示Vv=Vx/VrVx表示某种结构成分的体积，Vr表示参照系的体积体密度的面分析、线分析、点分析因为在细胞不同截面上的结构是有差异的，而且同一细胞群体和各细胞之间也有差异，所以必须随机拍摄大量（一般在30张以上）不同细胞不同切面的照片进行测量及统计，才能得出可靠的结果。二、面密度（Surfacedensity）表示膜面积的相对多少的量，用Sv表示Sv＝某种膜结构的面积Sx参照系的体积Vr曲线的长度（Lengthofcurve）膜在二维图像上显示为曲线，一般而言，曲线的形状是不规则的，用图像分析仪可以测出曲线的长度；如没有图像分析仪，可用一组平行等距的测试线测出。曲线长用B表示，测试线的间距为L，曲线与测试线的交点数为I，用几何概率的方法可以证明：B=L·I·π/2